【文献紹介#14】混合製剤に含まれる個々のモノクローナル抗体の定量方法

こんにちはJunonです。

本日公開された研究論文（英語）の中から興味のあったものを一つ紹介します。

出典

タイトル：A hydrophobic interaction chromatography method suitable for quantitating individual monoclonal antibodies contained in co-formulated drug products

著者：Lin Luo, Bowen Jiang, Yuan Cao, Long Xu, Mohammed Shameem, Dingjiang Liu

雑誌：J Pharm Biomed Anal.

論文公開日：2021年1月30日

どんな内容の論文か？

「2 つ以上の抗体を含むモノクローナル抗体（mAb）混合製剤は、いくつかの治療上の利点がある。しかし、mAbの生化学的および物理学的特性が類似しているため、製剤中の個々の抗体を定量することは困難である。3種類のmAbs を個別に定量するための疎水性相互作用クロマトグラフィー法(HIC法)を開発し、正確な定量性を示した。この方法は、各mAbの安定性試験における濃度変化をモニターするために適した方法である。」

背景と結論

モノクローナル抗体（mAb）治療薬は、より高い標的特異性、より長い半減期、規制当局による承認の可能性の高さなど、低分子医薬品と比較していくつかの利点があることが実証されています。現在、550 以上の抗体が治療薬として開発されていますが、その多くは二重特異性抗体、抗体医薬コンジュゲート、抗体フラグメントなどです。これらの新しい抗体モダリティに加えて、複数の抗体からなる混合製剤は、有効性の改善および/または有害事象の減少の可能性があるため大変有望なものです。共形成されたモノクローナル抗体医薬品は、典型的には、2つまたは3つの異なるモノクローナル抗体を含みます。モノクローナル抗体は分子量や構造が非常に類似しているため、共形成製剤中の個々の抗体の特性評価は単一の抗体医薬品を分析するよりも難しく、包括的な特性評価を達成するためには複数の検査法を必要とすることが多いです。

mAb製剤（DP）中のタンパク質含有量の試験は品質管理において大変重要であり、正確な測定が必要とされます。タンパク質含有量を定量するための一般的な技術には、UV分光光度法、ブラッドフォード蛋白アッセイ、ELISA）、逆相（RP）クロマトグラフィーおよび液体クロマトグラフィー-質量分析法（LC-MS）などがあります。しかし、これらの方法は、mAb共形成製剤中の個々のmAb含有量を定量するのに適していないか、または使用を妨げる他の制限があります。

紫外線分光光度法は、mAbの紫外線吸光度シグナルが吸光度波長で重なるため、この目的には使用することができません。逆に、LC-MSやELISAのようなタンパク質特異的アッセイは、個々のmAbsを完全に分離する必要なく、混合されたDP中の個々のmAbsを定量することができるかもしれません。LC-MSで採用されている最新の質量分析法は1Da以上の分解能を有しており、個々のmAb成分の測定に適しています。このような利点があるにもかかわらず、LC-MSは装置のコスト、専用のデータ解析ソフトウェアや十分な訓練を受けたスタッフが必要であるため、品質管理（QC）の測定としては不可能なことが多いです。ELISA は、特定の抗原との結合に基づいて共調合された DP 中の個々の抗体を定量することができますが、抗原のロット間のばらつきや試料調製に伴う誤差により、精度に問題があるため、QC 測定には適していません。

サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）、イオン交換クロマトグラフィー（IEC）、RP、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）などの液体クロマトグラフィー分析法は、創薬、開発、製造のさまざまな段階でmAbsの特性評価に広く使用されています。SECは、高分子量種をモノマーやフラグメントから分離するなど、サイズの違いに基づいて分析対象物を分離するものです。陽イオン交換クロマトグラフィー（CEX）および陰イオン交換クロマトグラフィーを含むIECは、表面電荷によってmAb種を分離し、個々のmAbの電荷の不均一性を評価するために非常に有用な技術であす。RPはタンパク質の疎水性に基づいた分離を実現し、mAb定量のためのUV分光光度法を補完する方法として使用することができます。

RPと同様に、HICもまた、疎水性の違いに基づいて溶液中の個々のタンパク質を分離します。移動相中の高濃度の極性塩の存在下では、個々のmAbsは、優先的な疎水性相互作用のために弱く疎水性の定常相に結合します。勾配溶出（塩濃度の低下）は、固定相と分析物の間の疎水性相互作用を徐々に弱めることで、個々の抗体の分離を可能にします。HIC法は疎水性のわずかな違いに高感度であり、1つのアミノ酸だけの違いで異なるmAb種を分離することができることが多いです。HPLCまたはUPLCを用いたHICの一般的なアプリケーションには、mAbの精製、mAbの異性化と酸化の特性評価、抗体医薬品コンジュゲート生成物の薬物/抗体比（DAR）の決定、およびmAbの相対的な疎水性の特性評価が含まれます。最近では、HICを用いてDPから2つのmAbを分画することができるようになりました。本研究では，サイズ，構造，電荷特性が類似した3種類のmAbを分離できる新規なHIC法を開発し，3種類のmAb共形成製剤を構成する個々のmAbの濃度を定量することに成功しました。HIC法は、SEC、RP、CEX、iCIEFを上回る性能を示しました。

この方法は，各mAbについて75～300μgの範囲で，許容できる精度（2％以下），正確度（91％～106％），直線性（R2＞0.99）を有していることが確認されました。これらの確認結果から、本HIC法は正確かつ確実にDPの各mAb濃度を測定することができ、DPの安定性試験の品質管理の方法として使用できる可能性があることが示されました。

最後に

生物医薬品の開発は近年急激に増加しており、今後も新しい製剤の開発が期待される。人工抗体の遺伝子改変も進化し、その形態は多岐に渡ってきている。複合的な治療を目的とし、同一製剤中の複数のmAbが混合処方されるようになっており、その安定性評価にはコストが掛かります。今回の新しい分析法は抗体医薬品の開発の進展に役立つものと考えられます。

おしまいです。

次回の記事までお待ちください。