【文献紹介#40】HMGB1はNrf2経路を介してフェロトーシスを制御する

こんにちはJunonです。

本日公開された研究論文（英語）の中から興味のあったものを一つ紹介します。

出典

タイトル：HMGB1 regulates ferroptosis through Nrf2 pathway in mesangial cells in response to high glucose

著者：You Wu, Ying Zhao, Han-Ze Yang, Yan-Jun Wang, Yan Chen

雑誌：Biosci Rep.

論文公開日：2021年 2月26日

どんな内容の論文か？

フェロトーシスは、糖尿病性腎疾患をはじめとする様々なヒト疾患の炎症や酸化に関与している。本研究では、中膜細胞における高グルコース応答性フェロトーシスの制御におけるHMGB1の役割について検討した。糖尿病性腎症（DN）患者では，健常対照と比較して、血清フェリチン、乳酸脱水素酵素（LDH）、活性酸素種（ROS）、マロナールアルデヒド（MDA）、HMGB1のレベルが有意に上昇していた。長鎖アシル-CoA合成酵素4（ACSL4）、プロスタグランジンエンドペルオキシド合成酵素2（PTGS2）、NADPHオキシダーゼ1（NOX1）、グルタチオンペルオキシダーゼ4（GPX4）などのフェロトーシス関連分子の制御低下を伴っていた。エラスチンと高グルコースの両方が中膜細胞のフェロトーシスを誘導することがin vitroアッセイで明らかになった。HMGB1を抑制することで、メサンジアル細胞の細胞増殖が回復し、活性酸素やLDHの発生が抑制され、ACSL4、PTGS2、NOX1が減少し、GPX4レベルが上昇した。さらに、DN患者では核内因子E2関連因子2（Nrf2）が減少し、メサンジアル細胞ではHMGB1の高グルコース媒介転座が認められた。また、HMGB1 のノックダウンにより、高グルコースによるTLR4/NF-κBの活性化が抑制され、Nrf2 の発現が促進され、その下流標的であるHO-1、NQO-1、GCLC、GCLMの発現が促進された。以上のことから、HMGB1は中膜細胞においてNrf2経路を介してグルコース誘導性フェロトーシスを制御していることが示唆された。

背景と結論

糖尿病性腎疾患は、高アルブミン尿、高血圧、糸球体濾過率（GFR）の低下を特徴とする糖尿病の最も一般的な合併症の一つである。先進国では末期腎疾患（ESRD）の原因の第一位であり、中国ではESRD症例の約16.4％を占めており、糖尿病患者の罹患率・死亡率の大幅な増加をもたらしている。そのため，糖尿病性腎疾患の病態解明と治療介入の開発が重要である。

プログラム化された細胞死は、自然免疫応答によって引き起こされる炎症過程と密接に関連した複雑なメカニズムによって制御されている。新しいタイプのプログラム細胞死であるフェロトーシスは、様々なヒト疾患の炎症や酸化に関与していることが証明されている。フェロトーシスは、アポトーシス、壊死、オートファジーとは形態的にも生化学的にも遺伝的にも異なるものである。フェロトーシスは、鉄に依存した活性酸素種（ROS）の蓄積と脂質過酸化によって特徴づけられるが、これは親油性抗酸化剤、鉄キレート剤、脂質過酸化の阻害剤によって阻害される可能性がある。フェロトーシスはヒトの疾患に関与しているが、その正確な調節機構と生物学的機能はいまだ解明されていない。

HMGB1は、クロマチンリモデリングやDNA組換え・修復過程に関与する転写因子である。HMGB1は細胞核内に豊富に存在し、肺胞上皮細胞、肺胞マクロファージ、浸潤性炎症細胞で有意に発現している。細胞質内のHMGB1は、細胞表面膜上で発現するように転座したり、細胞傷害時に細胞外空間に拡散したりする。細胞外HMGB1は、NF-κBを活性化するシグナル伝達カスケードを誘導することができ、炎症性サイトカインの合成につながる。HMGB1とその受容体間の相互作用を遮断することは、糖尿病性腎症（DN）の発症予防に有効であることが証明されている。我々の先行研究でも、高グルコースに反応してHMGB1がDN患者や中膜細胞で活性化されることが示されている。また、HMGB1は、DNではToll様受容体経路を活性化することで炎症を媒介している可能性があると考えられている。最近では、HMGB1がRAS-JNK/p38経路を介したフェロトーシスの新規調節因子であることが報告されており、白血病の治療標的となる可能性がある。しかし、HMGB1 がDNのフェロトーシスにどのような役割を果たしているのかは不明である。

DN患者におけるフェロトーシスの亢進

DN患者と健常者のフェロトーシスのレベルを検出した。DN群の平均年齢は55.07±4.14歳の男性14名、女性16名、対照群の平均年齢は52.53±5.17歳の男性10名、女性20名であった（P=0.133）。DN群と対照群の体格指数（BMI）、空腹時血糖値（FPG）、糖化ヘモグロビンA1c（HbA1c）、総コレステロール値（TC）、トリグリセリド値（TG）、高密度リポ蛋白コレステロール（HDL-C）、低密度リポ蛋白コレステロール（LDL-C），空腹時インスリン値（FINS），インスリン抵抗性のホメオスタシスモデル評価（HOMA-IR）などの詳細値を表1に示した。驚くことではないが、FPG、HbA1c、TG、TC、BUNなどの値は、DN群の方が有意に高かった。

フェリチンとLDHの放出、活性酸素とMDAの産生などがフェロトーシスの指標となった。その結果、DN患者では血清フェリチンとLDHの放出量が増加していることが確認された。さらに、HMGB1もDN患者の血清中で顕著に上昇していた。さらに、リアルタイムPCRを用いて、ACSL4、PTGS2、NOX1、GPX4を含むフェロトーシス関連タンパク質の発現を検出した。データは、DN患者はACSL4、PTGS2およびNOX1の発現が上昇し、GPX4のレベルが低下していることを示した。これらのデータは、DNの病態においてフェロトーシスレベルが亢進していることを示唆している。

中膜細胞における高グルコース誘起フェロトーシスの研究

フェロトーシスの古典的な誘導剤であるエラスチンを、高グルコース（２５ｍＭ）で処理した中膜細胞において、この側面を評価するために使用した。LDH放出アッセイにより細胞膜透過性を測定した。高グルコース（25 mM）とエラチン（5 μM）は共にLDH放出を有意に誘導したが、鉄キレート剤DFX（200 μM）はSV40 MES 13細胞においてグルコース誘導LDH放出を逆転させた。さらに、リアルタイムPCRにより、エラチンとグルコースへの曝露はACSL4、PTGS2、NOX1の発現を促進し、GPX4レベルを低下させることが示された。これらのデータを総合すると、高グルコースが中膜細胞においてフェロトーシスを誘導することが示唆される。

中膜細胞におけるグルコース誘導性フェロトーシスを媒介するHMGB1

CCK-8は、高グルコース処理が細胞生存率を劇的に低下させることを示したが、HMGB1 siRNAによるトランスフェクションはSV40 MES1細胞生存率を有意に上昇させた。フェロトーシスにおけるHMGB1の役割を調べるために、LDH放出アッセイによって細胞膜透過性を測定した。高グルコースは有意にLDH放出を誘導したが、HMGB1の枯渇はLDHの放出を抑制した。さらに、ウエスタンブロットは、HMGB1 siRNAによるトランスフェクションは、グルコース処理の有無にかかわらず、SV40 MES13細胞におけるHMBG1の細胞外レベルを有意に減少させることを示した。さらに、リアルタイムPCRを用いて、フェロトーシス関連バイオマーカーの発現を検出した。その結果、グルコース処理したSV40 MES13細胞では、ACSL4、PTGS2、およびNOX1の発現が上昇し、GPX4レベルが低下したのに対し、HMGB1の欠失はACSL4、PTGS2、およびNOX1の発現を抑制し、GPX4レベルを上昇させた。これらのデータをまとめると、HMGB1の抑制が中膜細胞におけるグルコース誘導性フェロトーシスを抑制することが明らかになった。

HMGB1は高グルコースへの曝露時にフェロトーシス誘導酸化ストレスを制御する

フェロトーシスは、脂質過酸化と膜透過性の破壊につながる過剰な酸化ストレスによって特徴づけられる。この現象を評価するために、酸化還元感受性プローブCM-DCFDAを用いた。その結果、DN患者の血清では、活性酸素とMDAの産生が上昇していることが確認された。さらに、高グルコースは広範な酸化ストレスを誘発し、HMGB1をノックダウンすることでそれが抑制されることがデータで示された。このような酸化状態におけるフェロトーシスの役割を検証するために、我々はDFXとフェロトーシスの古典的な誘導因子であるエラスチンを用いた鉄キレーションを適用した。その結果、高グルコースに曝露してもしなくても、DFXにより酸化ストレスが抑制されることが示された。一方、活性酸素の産生は、フェロトーシス誘導剤エラスチンとの治療時にさえ上昇した。炎症反応におけるHMGB1の役割を探るために、我々は高グルコースへの曝露時に炎症性サイトカインを検出した。我々は、グルコースで処理されたSV40 MES 13細胞がIL-6およびTNF-αの上昇した産生を示し、これらはSV40 MES 13細胞におけるHMGB1の干渉によって抑制されたことを発見した。これらのデータをまとめると、HMGB1は高グルコースへの曝露時にフェロトーシス誘導酸化ストレスを制御することが示唆される。

HMGB1はNrf2シグナル伝達経路を介してグルコース誘導性フェロトーシスを制御している。

Nrf2は酸化的傷害から身を守るために重要な転写因子である。ELISAおよびリアルタイムPCR法により、DN患者では対照群に比べて血清Nrf2が有意に減少していることが明らかになった。細胞成分分析の結果、高グルコース刺激によりHMGB1が核から細胞質に転座することが明らかになった。さらに、高グルコース処理は明らかにNRF2のmRNAとタンパク質レベルを低下させたが、HMGB1のノックダウンは中膜細胞におけるNrf2の発現を促進した。さらに、高グルコースはTLR4およびp-NF-κB p65を顕著に増加させ、HMGB1 siRNAはメサンジアル細胞におけるTLR4/NF-κBシグナル伝達経路の高グルコース誘発活性化を抑制した。さらに、HMGB1の抑制は、SV40 MES 13細胞において、HO-1、NQO-1、GCLC および GCLM を含むNrf2下流標的のグルコース誘発性低下を逆転させた。これらの知見をまとめると、HMGB1は中膜細胞においてNrf2シグナルを介してグルコース誘導性フェロトーシスを制御していることが示唆される。

HMGB1は DNA結合性非ヒストン蛋白質であり、DNAの複製、転写、修復に関与している。その核機能に加えて、細胞外HMGB1は、ヒト疾患における炎症性メディエーターであると考えられている。本研究では、HMGB1の上昇が、フェロトーシス関連マーカーの抑制を伴うDN患者で観察された。さらに、HMGB1が中膜細胞のフェロトーシスに関与していることを明らかにし、DNの新規治療標的となることが示唆された。

フェロトーシスの概念が報告されて以来、この新しい細胞死の形態が、癌、動脈硬化、神経変性疾患などのヒト疾患の発症や進行に密接に関係していることが、研究の蓄積により明らかになってきた。フェロトーシスは、鉄依存性の非アポトーシス制御細胞死の一形態であり、致死的な脂質ヒドロペルオキシドの蓄積と脂質修復酵素の活性の喪失によって特徴づけられる。最近の研究では、フェロトーシスが多嚢胞性腎疾患、急性腎損傷、腎細胞癌などの多様な腎疾患に関与していることが示されている。また、糖尿病心筋虚血・再灌流障害、膵島の生存・機能、糖尿病性心筋症にもフェロトーシスが関与していることが明らかになっている。しかし，糖尿病性腎疾患におけるフェロトーシスの制御的役割は未だ不明である。本研究では、フェリチン、LDH、活性酸素、MADなどのフェロトーシスの指標であるフェリチン濃度の上昇が観察された。フェリチン低下の誘導は、ACSL4、PTGS2、NOX1の上昇、GPX4の低下と関連していることが示唆されている。驚くべきことに、DN患者ではACSL4、PTGS2、NOX1が上昇し、GPX4レベルが低下していた。また、in vitroアッセイでは、高グルコースと強直症の古典的な誘発因子であるエラチンの両方が強直症を誘発することが確認されたが、これはSV40 MES 13細胞で鉄キレート DFX を投与することで逆転した。これらの知見をまとめると、高グルコースが高グルコースに反応して中膜細胞のフェロトーシスを誘導することが主に明らかになった。

DNでは、HMGB1発現のアップレギュレーションがDNを持つヒト腎臓の腎尿細管で検出された。高グルコースによる刺激は、尿細管上皮細胞およびpodocytesによる内因性HMGB1の放出を促進し、HMGB1の遮断はin vivoでの糖尿病性腎障害を減衰させる。また、高グルコースが内因性HMGB1の細胞質への転座を促進することも明らかにした。フェロトーシスにおけるHMGB1の制御的役割を探るために、我々は中膜細胞における HMGB1のレベルを操作した。その結果、HMGB1を抑制することにより、高グルコースに曝露したメサンギアル細胞において、細胞増殖が回復し、活性酸素の産生が抑制され、フェロトーシスが逆転し、炎症性サイトカインが減少した。これらの結果から、HMGB1の発現抑制は、グルコース誘発性のフェロトーシス、過剰酸化、炎症に対して有益な役割を果たしていることが明らかになった。

Nrf2は、酸化ストレスに対する防御応答のマスターレギュレーターとして同定された転写因子である。外部刺激を受けると、Nrf2は脱ユビキチン化されて核に移動し、抗酸化応答エレメント（ARE）と相互作用して標的遺伝子の転写を活性化する。酸化ストレスや炎症反応は糖尿病の進行に重要なメディエーターであることから、Nrf2を糖尿病の新規ターゲットとして開発することは合理的であると考えられている。Nrf2シグナル伝達経路の最近の知見の一つは、フェロトーシスに対するものである。さらに、HMGB1/TLR4/NF-κBやNrf2/HO1経路がシスプラチン誘発性腎毒性に関与していることが明らかになっている。

最後に

本研究では、HMGB1が糖尿病性腎疾患でNrf2シグナルに依存してフェロトーシスを制御しているかどうかを探った。糖尿病腎の臨床サンプルと高グルコース処理した中膜細胞では、Nrf2だけでなく、HO-1、NQO-1、GCLC、およびGCLMを含むその下流の標的も減少していた。さらに、HMGB1 を抑制することで、SV40 MES 13 細胞ではグルコース誘導性の TLR4/NF-κB の活性化と Nrf2 の減少が逆転したことから、HMGB1 は Nrf2 を介したフェロトーシスの新規制御因子であることが示唆された。

以上の結果から、HMGB1 は高グルコース処理したメサンジアル細胞において、核から細胞質へと転移し、Nrf2 シグナル伝達経路に依存したフェロトーシスのポジティブな制御因子として機能していることが示唆された。これらの知見は、HMGB1とフェロトーシスを標的とした糖尿病性腎疾患の新規治療法を提供するものである。

おしまいです。

次の記事までお待ちください。