【文献紹介#35】Tヘルパー細胞エピトープを組み込んだ組換えSARS-CoV-2 RBDは強い中和抗体反応を誘導

こんにちはJunonです。

本日公開された研究論文（英語）の中から興味のあったものを一つ紹介します。

出典

タイトル：Recombinant SARS-CoV-2 RBD with a built in T helper epitope induces strong neutralization antibody response

著者：Qiu-Dong Su, Ye-Ning Zou, Yao Yi, Li-Ping Shen, 他

雑誌：Vaccine.

論文公開日：2021年2月20日

どんな内容の論文か？

COVID-19は現在までに2,600万人以上の患者と約86万4,000人の死亡者を出しており、世界中に広がっている。効果的で安価なワクチンが緊急に必要とされている。SARS-CoV-2のスパイクタンパク質のVal308-Gly548に破傷風トキソイド（TTペプチド）のGln830-Glu843を連結したもの（S1-4）と、TTペプチドを連結していないもの（S1-5）を発現させ、再変性させた。Ｓ１-４の抗原性および免疫原性は、それぞれマウスのインビトロでのウエスタンブロッティング（ＷＢ）および免疫応答により評価した。中和効率は、マイクロ中和アッセイ（MN50）により予備的に測定した。可溶性のS1-4およびS1-5タンパク質は、高い均質性および純度に調製した。ミョウバンでアジュバントしたところ、S1-4タンパク質は、免疫化されたマウスにおいて強い抗体応答を刺激し、Th1型免疫を補う主要なTh2型細胞免疫を引き起こした。さらに、免疫化された血清は、中和抗体価256でSARS-CoV-2感染からVeroE6細胞を保護することができた。Ｔヘルパー細胞エピトープを組み込んだ組換えSARS-CoV-2 RBDは、マウスの細胞性免疫を補足した強力な体液性免疫の両方を刺激することができ、それが有望なサブユニットワクチン候補であり得ることを実証した。

背景と結論

コロナウイルス病（COVID-19）は、世界保健機関（WHO）によってパンデミックと主張され、最初は中国で報告された。2020年8月12日までのCOVID-19の症例数は26,121,999例で、全世界で864,618人が死亡したと報告されている。

COVID-19は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）によって引き起こされる。コロナウイルスは、エンベロープ型の一本鎖RNAウイルスであり、ヒトだけでなく、幅広い動物に感染する。SARS-CoV-2は、SARS-CoVウイルスと密接に関連しており、β-コロナウイルスのB系統に属している。現在、世界では100種類以上の候補ワクチンが開発されており、不活化ウイルスワクチン、組換えタンパク質サブユニットワクチン、核酸ワクチンなどのワクチン技術が評価されている。SARS-CoVワクチンのこれまでの経験に基づき、SARS-CoV-2ワクチンは、感染性の増加または好酸球浸潤につながる可能性のある免疫増強（すなわち、抗体依存性の増強）を控えるべきである。したがって、サブユニットワクチンは、その構成が単純であり、制御不能な危険因子が少ないことから、最良の候補ワクチンの一つである可能性がある。

HCoV-OC43およびHKU1βコロナウイルスには、ヌクレオカプシドタンパク質（N）、スパイクタンパク質（S）、小膜タンパク質（SM）、膜糖タンパク質（M）の4つの主要な構造タンパク質があり、さらに膜糖タンパク質（HE）が追加されている。他のコロナウイルスと同様に、SARS-CoV-2は、アンジオテンシン変換酵素II（ACE2）を細胞受容体とする受容体介在性エンドサイトーシスによって肺胞上皮細胞に感染する。SARS-CoV-2は、Sタンパク質の受容体結合ドメイン（RBD）でACE2と結合する。完全長S（S1およびS2）またはRBDを含むS1は、ウイルス感染を防ぐ中和抗体を誘導する可能性がある。RBDは他のS1部分とは構造的にも機能的にも異なり、安定性が高くコンパクトである。多くの研究者が、RBDが中和エピトープを含むT細胞やB細胞エピトープを豊富に含むサブユニットワクチンとしての可能性を実証してきた。サブユニットワクチンは安全性が高く、安定した生産が可能であり、体液性免疫応答を誘導することができるだけでなく、より重要なことは、高レベルの中和抗体を誘導し、効果的な保護を与えるために適切なアジュバントが必要である。

破傷風トキソイド（TT）は、Tヘルパーエピトープに富む抗原として、抗原性エピトープの体液性および細胞性免疫応答を効果的に増強することができると考えられている。TT は必要な免疫学的増強作用を発揮し、効果的な T-B 細胞反応を達成することで高レベルの抗体産生を促進する。TTは安全性が高く、ヒトワクチンの製造にも実用化されていることから検討されてきた。一般的にほとんどの人はTTに対する免疫反応を持っているため、得られた抗体は、抗体-抗原複合体の形態を介して、新しい抗原に対する免疫反応の免疫調節として機能する可能性がある。TT（TTペプチド）のGln830 - Glu843は、プロミスキュアスTヘルパーエピトープとして、DR3対立遺伝子への強い結合能を有しており、外因性エピトープの免疫原性を高め、サブユニットワクチンの細胞免疫を誘導するためのT細胞刺激剤として頻繁に使用されている。TT ペプチドはわずか 14 アミノ酸であり、組換えタンパク質の形で容易に発現し、理論的にはエピトープ認識や結合への干渉を最小限に抑えることができた。

特定の予防策がない場合、現在の効果的な管理は、主に検疫の実施、隔離、物理的な距離（すなわち陰圧隔離）に焦点が当てられている。効果的で安価なワクチンが早急に必要とされている。本研究では、RBD結合TTペプチドの新規分子（S1-4と命名）を調製し、その抗原性、免疫原性、保護効率をサブユニットワクチンの候補として予備的に評価した。

S1-4タンパク質の抗原性は、Sino Biological社（北京、中国）がバキュロウイルス-昆虫細胞で発現させた市販の組換えRBDタンパク質（スパイクタンパク質のVal16-Arg685; 76.45 kDa）をポジティブコントロールとしてWB分析によって実証された。RBDに対するウサギモノクローナル抗体、不活化SARS-CoV-2に対するラットポリクローナル抗体、またはCOVID-19患者の回復期血清を一次抗体とした場合でも、約30 kDaに明らかなバンドがあり、S1-4タンパク質の抗原性の高さを示唆していた。また、約59kDaにも明らかなバンドがあり、これはおそらく二量体であると思われる。また、約87 kDaには三量体のMWであるバンドは見られなかたｔ。 

SARS-CoV-2候補サブユニットワクチンの免疫原性を解析するために、不活化SARS-CoV-2をベースとしたELISA法により、免疫したマウスの血清中の抗SARS-CoV-2抗体価を測定した。S1-4/Alumで免疫したマウスの抗体価（GMT）は、1回目の注射から1週間後に100となり、2回目の注射から1週間後には1481まで上昇した。しかし、S1-5/Alumで免疫したマウスの抗体価（GMT）は、1回目の注射では24、2回目の注射では192にとどまった。最後に、3回目の注射から1週間後、S1-4/Alumで免疫したマウスの抗体価（GMT）は1728であったのに対し、S1-5/Alumでは456であった。明らかに、TTペプチドテールに連結されたS1-4は、TTペプチドを持たないS1-5よりも免疫原性が高いことがわかった。同様に、抗体価は、S1-4とS1-5タンパク質の間の２回目の免疫化後に急速に増加した。興味深いことに、同じサンプリング時間で、S1-4/Alumで免疫したマウスの抗体価は、S1-5/Alumで免疫したマウスの抗体価のほぼ４倍であり、ＴＴペプチドの強力な免疫調節を示唆していた。

S1-4/Alumで免疫したマウスの中和抗体価（MN50）は、28日目（2回目の免疫から1週間後）に192、35日目（3回目の免疫から1週間後）に256に達した。しかし、S1-5/Alumで免疫したマウスの血清の中和抗体価（MN50）は、Day28で48、Day35で64にとどまった。さらに、中和抗体価は、S1-4タンパク質を免疫したマウスでも、S1-5タンパク質を免疫したマウスでも、総抗体価とともに上昇した（P＜0.05）。また、同じサンプリング時間における抗SARS-CoV-2抗体価は、中和抗体価の約7倍であった（P＜0.05）。これらの結果から、TTペプチドはより多くの総抗体産生を刺激することで中和抗体量を増加させていることが示唆された。

免疫化したBalb/cマウスの脾臓細胞中のIL-4およびIFN-γのスポット形成細胞（SFC）をELISpotアッセイで計数した。S1-4/AlumにおけるIL-4のSFCは346.7±19.6（平均±SD）、IFN-γのSFCは212.7±7.8であった。S1-5/AlumにおけるIL-4のSFCは143.4±11.7、IFN-γのSFCは69.3±19.4であった。S1-4/Alum群でもS1-5/Alum群でも、IL-4のSFCはIFN-γのSFCよりも多く、マウスの主要なTh2型免疫を示唆していた。さらに、両群ではかなりの数のIFN-γのSFCが存在していた。これらの結果は、S1-4およびS1-5タンパク質に対する免疫応答には、Th2（IL-4）だけでなく、Th1（IFN-γ）のSFCも関与していることを示唆している。驚くべきことに、IL-4とIFN-γの両方のSFCは、S1-5/Alum群よりもS1-4/Alum群の方が多かった（P < 0.05）。S1-4またはS1-5タンパク質によって引き起こされる免疫応答タイプは、主にTh1タイプの免疫を補足したTh2タイプの免疫に基づいていた。

Balb/cマウスでは、IgG1対IgG2aもまた、Th2-Th1免疫の差を反映しており、IgG1/IgG2a比は生体内の免疫機能を間接的に反映していた。したがって、SARS-CoV-2に対するIgG1およびIgG2aの抗体価（GMT）およびIgG1/IgG2a比をELISA法により測定した。S1-4/Alum群のIgG1抗体価は1132.6±103.4（平均±SD）、IgG2a抗体価は400.5±77.4であった。明らかに、S1-4/Alum群ではIgG1価がIgG2a価を上回っていた（P < 0.05）。S1-5/Alum群のIgG1価は340.5±42.8であり、IgG2a価は124.4±14.9であった。明らかに、S1-5/Alum群ではIgG1抗体価もIgG2a抗体価を上回っていた（P < 0.05）。IgG1/IgG2aの比は、S1-4/Alum群では2.95±0.75、S1-5/Alum群では2.79±0.56であった。また、IgG1/IgG2a比には両群間で有意差は認められなかった（P＞0.05）。したがって、IgG1応答はIgG2a応答よりも強く、マウスの主要なTh2型免疫を示唆していた。

構造と機能が独立していることから、RBDはSARS-CoV-2サブユニットワクチンの理想的な選択となった。組換えRBDタンパク質の発現には、CHO-、バキュロウイルス、酵母などのいくつかの発現系が使用されてきた。特に SARS-CoV-2 ワクチンが世界的に緊急に必要とされている状況下では、その効率性、時間短縮、安全性を考えれば、大腸菌発現システムに勝るものはなかった。Xia は、大腸菌発現系を用いて E 型肝炎ウイルス（HEV）ワクチンとヒトパピローマウイルス（HPV）ワクチンの開発に成功している。原核生物発現系のアプローチにより、候補ワクチンが承認されれば、年間生産量は数十億本に達し、世界規模でのCOVID-19の予防・撲滅が可能となる。

しかし、原核生物発現系を適用した場合には、糖鎖化と再変性という3つの重要な問題が発生する。第一に、Val308 - Gly548内には、2つの予測可能なN-連結部位（Asn331とAsn343）とO-連結部位（Thr323とThr385）のグリコシル化部位しか存在しない。実際に、バキュロウイルス発現系で発現した Val308 - Gly548 は、3N グリコシル化部位と 10O グリコシル化部位を有していた。しかし、いずれの部位も結合している ACE2 から離れていた。このことから、RBDのこれらの部位のグリコシル化は、抗原性や免疫原性を維持するためには重要ではないと推測された。本研究では、グリコシル化されていないS1-4タンパク質は抗原性と免疫原性があり、防御免疫を刺激するのに十分であったが、S1-4タンパク質はバキュロウイルス発現系で発現させた市販のRBD（スパイクタンパク質のVal16-Arg685）よりもポリクローナル血清との反応性が低いように思われた。驚くべきことに、抗S1-4タンパク質抗体価は、抗SARS-CoV-2抗体価よりもはるかに高いことがわかった（P＜0.05）。第二に、4つのジスルフィド結合（Cys336-Cys361、Cys379-Cys432、Cys480-Cys488、Cys391-Cys525）が存在することは、RBDの自然構造の再構築に大きな困難をもたらす。本研究では、透析液バッファーの詳細な組成が公表されており、その有効性は、以前に行った組換えSARS-CoV RBDの再変性の研究でも確認されている。最後に、S1-4タンパク質のモノメリック型（29.0 kDa）、二量体型（59.0 kDa）、三量体型（87.0 kDa）の3種類の凝集状態をSECクロマトグラフィーで実証した。さらに、WBゲル中にも二量体および二量体の形態が見られた。しかし、S1-4タンパク質の3量体構造は、直径9.133 nm、分子量89.1 kDaであり、SEC上の予測構造とピーク曲線下面積から最も説得力のあるものであった。

Th1細胞はIFN-γなどの細胞介在性免疫応答を促進するサイトカインを産生する一方、Th2細胞はIL-4、IL-5、IL-13などのサイトカインを誘導し、体液性免疫応答を活性化する 。現在、Th1型応答がSARS-CoVおよびMERS-CoVの制御を成功させる鍵であることが強く示唆されており、おそらくSARS-CoV-2についても同様であると考えられる。IgG2a（Th1型）の刺激はマウスにおけるワクチン接種の有効性の増加と関連している。全体として、SARS-CoV-2感染を制御するためには、体液性免疫（Th1型）と細胞性免疫（Th2型）の両方が必要であった。ELISpotアッセイによると、S1-4/Alumは、後者が優勢であったが、マウスにおいてTh1型およびTh2型免疫応答を同時に刺激することができた。抗SARS-CoV-2抗体アイソタイプ分析もまた、IgG1応答がIgG2a応答を補って優勢であり、IgG1/IgG2a比が2.95であることを示した。さらに、TTペプチドは、Th1およびTh2型サイトカインを含むサイトカイン分泌の促進に重要な役割を果たした。TTペプチドが強力なT細胞エピトープとしてコンストラクトに存在することで、抗原提示の過程でT-B細胞の反応が確実に行われることがわかった。S1-4とS1-5の両方によって引き起こされる類似のIL-4/IFN-γ比にもかかわらず、絶対値は異なっていた。S1-5はTTペプチド以外は同じT細胞エピトープを保有していた。免疫応答増強におけるＴＴペプチドの効果は明らかであり、特にＴｈ２型免疫であった。ほぼすべての人がTTペプチドに対する既存の免疫を持っており、これは免疫調節に役立つであろう。

ワクチンには中和効果が重要である。体液性免疫応答、特に中和抗体応答は、後の段階での感染を制限し、将来の再感染を防ぐという重要な役割を果たしている。免疫血清の中和活性は、候補ワクチンが成功するかどうかを判断する鍵となることが多い。Wu, et al.は、抗組換えSARS-CoV-2 Sタンパク質（Sino Biological, Beijing, China）抗体と中和抗体を高力価で筋肉内投与することで、SARS-CoV-2全長スパイクタンパク質を発現するAd5-nCoVがマウスに強力な体液性免疫応答を誘導できることを発見した。本研究では、S1-4タンパク質もマウスに高力価の抗SARS-CoV-2抗体および中和抗体を誘導することができた。3回目の免疫化から1週間後、ELISAで検出された抗SARS-CoV-2抗体価は1728に達し、中和抗体価はMN50で測定した256に達した。対照的に、TTペプチドを含まないS1-5タンパク質はかろうじて満足できるものであった。Ad5-nCoVワクチンで誘発された中和活性は、SARS-CoV-2中和アッセイに基づくマウスの中和活性は約28（256）に達した。この研究では、免疫血清はDay35の中和抗体価256でSARS-CoV-2感染からVero E6細胞を保護することができた。

最後に

Tヘルパーエピトープを組み込んだ組換えSARS-CoV-2 RBDは、原核生物システムとクロマトグラフィー精製により、理想的な抗原性と免疫原性を有して調製することができた。Th2型免疫は、Th1型免疫を補完する形で優勢であった。免疫血清は、SARS-CoV-2感染からVeroＥ６細胞を保護することができた。このことから、このサブユニットタンパク質は理想的なワクチン候補になると考えられる。

おしまいです。

次の記事までお待ちください。